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LbuCas13a属于Ⅱ类Ⅵ型CRISPR系统效应蛋白，是由crRNA介导的核酸内切酶，在识别并切割靶标RNA时，其“附属切割”活性被激活，可非特异切割体系中单链 RNA(ssRNA)。
LbuCas13a Nuclease说明书
【产品名称】LbuCas13a Nuclease 【分子量】141.6KDa
【产品编号】EDE0002 【形式】液体
【产品简介】
LbuCas13a（又名C2c2）来源于Leptotrichia buccalis菌株。LbuCas13a属于Ⅱ类Ⅵ型CRISPR系统效应蛋白，是由crRNA介导的核酸内切酶，在识别并切割靶标RNA时，其“附属切割”活性被激活，可非特异切割体系中单链 RNA(ssRNA)。通过设计两端标记荧光基团或者其他标记物的RNA探针，可实现CRISPR/Cas13a对RNA模板的检测和信号放大。可通过荧光仪或试纸观察结果。
【产品组分】
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组分 |
EDE0002-100 |
EDE0002-500 |
EDE0002-1000 |
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LbuCas13a Nuclease |
5 μM*20 μL （100 pmol） |
5 μM*100 μL （500 pmol） |
5 μM*200 μL （1000 pmol） |
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LbuCas13a Cleavage Buffer（5×） |
500 μL*1管 |
500 μL*4管 |
1mL*4管 |
【储存条件及有效期】
有效期1年，保存条件-20°C；如长期储存，建议置于-80°C。
建议根据使用次数进行分装，避免反复冻融。
【产品特点】
采用一步法纯化制备，最大程度保留酶活性，经过测试酶活性显著高于同类产品。
【活性定义】
在总体积为25 μL的反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssRNA探针所需的Cas13a酶量定义为1 transU。
例：若某批次 LbuCas13a酶的反式切割活性为9 transU/pmol，则表明1 pmol的该批次LbuCas13a酶可在1 min内，在上述指定的反应条件下，反式切割9 pmol ssRNA探针。
【质量保证】
样品纯度：～95% （SDS-PAGE鉴定）。
【检测步骤】
需要准备的其它试剂
1. Reporter：Cas13a 切割底物。即在剪切反应体系中加入ssRNA报告探针，该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。可搭配我司的Reporter进行检测，或自行设计合成 Reporter。
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产品名称 |
编号 |
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ssRNA reporter（RNA探针） |
EDR0001 |
2. crRNA/gRNA：与Cas13a结合，形成功能复合物，被目标序列特异性激活。可选择我司的crRNA或自行设计合成crRNA。
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名称 |
规格 |
编号 |
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crRNA生物合成 |
2OD |
EDR0002 |
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crRNA化学合成 |
2OD |
EDR0003 |
免费设计咨询：info@edgene.cn
3. RNase Inhibitor （可选）：抑制RNase,防止RNA降解。（货号：AI101-02）
4. 恒温扩增反应试剂盒。
【测试反应体系】
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组分 |
体积/ μL |
终浓度 |
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5 μM LbuCas13a |
0.25 |
50 nM |
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5×Cleavage Buffer |
5 |
1× |
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25 U RNase Inhibitor |
1 |
1 U |
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500 nM crRNA |
2.5 |
50 nM |
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4 μM ssRNA Reporter |
2.5 |
400 nM |
|
1 μM RNA target |
1.25 |
50 nM |
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H2O |
- |
- |
|
Total |
25μL |
25μL |
【反应条件】
实时荧光定量PCR仪或恒温扩增仪检测荧光信号，37℃反应，每 30 sec 采集一次荧光信号。
【酶活性对比实验结果】
Fig 1. Results of Cas13 collateral cleavage at different concentration.
横坐标为反应时间，纵坐标为苏州克睿MA-1610恒温扩增仪检测结果。由图可见，5×10^9拷贝靶标RNA可高效激活LbuCas13a酶，10分钟内可完全切割RNA报告探针，并达到荧光峰值。
【注意事项】
1. 为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。
2. Cas13a 酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
