再创佳作！艾迪基因联合华南农业大学开发一种基于CRISPR的快速检测食品中的唐菖蒲伯克霍尔

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阴性菌，具有多种致病变种，在所有类型中，椰毒致病型菌株Burkholderia gladioli pv. cocovenenans (B. cocovenenans) 是目前在中国发现的发病率和死亡率最高的食源性致病菌。2020年，黑龙江省发生一起因家庭聚餐食用酸汤子引发的食物中毒事件，9人食用后全部死亡。现已查明致病食物是被椰毒致病型菌株污染的酸汤子。因此，开发一种快速检测食品中椰毒致病型菌株的方法尤为重要。

华南农业大学的沈兴课题组联合艾迪基因在《Foods》上发表了题为“Rapid and Simple Detection of Burkholderia gladioli in Food Matrices Using RPA-CRISPR/Cas12a Method”的文章，影响因子5.561，该研究建立了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的快速检测食品基质中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌方法。

 

结果：

（1）方法性能测试

提取了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌血清型和几种常见食源性致病菌(包括沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)的DNA进行特异性反应。结果如图1a所示，只有三种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌血清型可以激活Cas12a并产生可见荧光，而其他细菌完全没有观察到荧光，表明了RPA-CRISPR/Cas12a方法的高特异性。

在gDNA和细菌水平上测试了RPA-CRISPR/Cas12a方法的灵敏度。如图1b所示，在10−3 ng/µL(等于100 pg/µL)的gDNA浓度下，荧光亮度肉眼可见，与非靶对照明显不同。提取椰毒致病型DNA进行RPA-CRISPR/Cas12a 检测，结果如图1c所示，菌液检出限为101 CFU/mL。qPCR方法对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌gDNA的qPCR检出限为250 fg/µL(等于0.25 pg/µL)，对菌液的qPCR检出限为102 CFU/mL。与qPCR方法相比，RPA-CRISPR/Cas12a方法的gDNA检出限略低于qPCR法，但对菌液的检出限优于qPCR法。

（2）实际样品测试

本研究对均质米粉、新鲜白面、和糯米粉进行了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测，样品中最终细菌浓度范围为100 ~ 106 CFU/mL。在米粉、鲜白面和糯米粉样品中，RPA-CRISPR/Cas12a法对角兰伯克霍氏菌的检出限分别为101 CFU/mL、102 CFU/mL和102 CFU/mL。米粉样品的检出限与菌液相同，而鲜白面和糯米粉样品的检出限比菌液高一个数数。原因可能是不同样品的含水量不同。鲜白面和干糯米粉的含水率低于米粉;因此，它们可能提供更多的干扰检测的基质效应。

（3）方法验证

用qPCR法在三种样品中验证了RPA-CRISPR/Cas12a方法的准确性。如图3所示，用qPCR方法获得的米线、鲜白面和糯米粉中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检出限分别为101 CFU/mL、102 CFU/mL和103 CFU/mL。qPCR结果与RPA-CRISPR/Cas12a方法结果都有一致的趋势。事实上，RPA-CRISPR/Cas12a方法比qPCR法更加灵敏。这可能是由于qPCR和RPA对样品基质带来的抑制作用的耐受性不同所致。以上结果表明，RPA-CRISPR/Cas12a方法具有良好的特异性和灵敏度。

总结：

本研究建立了一种特异性的RPA-CRISPR/Cas12a快速检测食源性病原菌剑兰伯克氏菌的方法。该方法灵敏度高，特异性好，能准确检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，与其他常见病原菌无交叉反应。gDNA的检出限为10−3 ng/µL，菌液的检出限低至101 CFU/mL，优于标准qPCR方法。将该方法应用于食品样品中，米粉、鲜白面和糯米粉的检出限分别为101 CFU/mL、102 CFU/mL和102 CFU/mL，无需进行样品富集。检测步骤只需30分钟。关于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌快速检测方法的研究较少，且食品污染样品多为米粉制品，预处理也有一定困难。该方法具有较高的灵敏度，克服了从米线制品中提取DNA的复杂问题。而且，这种快速的方法可以在不需要大型设备的情况下执行，其灵敏度优于qPCR。因此，该方法对于现场高效、快速检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌方面具有良好的前景。

原文链接： https://doi.org/10.3390/foods12091760