一文让你轻松读懂CRISPR检测技术原理
01
CRISPR检测-认识CRISPR/Cas系统
为了测试化学合成的sgRNA用于基因组编辑的效用，作者对sgRNA进行三种不同的化学修饰，包含M、MS、MSP，加在5’和3’末端的三个核苷酸上，并评估其的最终效果。作者选择了三个已经被细胞系中具有高基因编辑频率的sgRNA靶向的人类基因：IL2RG，HBB，和CCR5。结果表明，通常情况下，化学修饰的sgRNA保持了高度的特异性。在靶和脱靶比率的差异表明sgRNA的化学变化具有调节活性的可能性。
为了进一步探索化学修饰的人类细胞系中的sgRNA，作者转向一个全RNA递送平台，联合递送sgRNA和编码Cas9的mRNA。并通过核转染的方式联合或连续递送Cas9和各种靶向IL2RG的合成sgRNA，探索化学修饰是否对sgRNA活性的半衰期有影响。之后，作者比较了未修饰和MS修饰的sgRNA在脱靶位点的活性。研究发现，当化学修饰的sgRNA与Cas9 mRNA共同递送或作为RNP递送时，在人类细胞系中显示出比未修饰的sgRNA更具优势的基因编辑。
为了进一步探索化学修饰的人类细胞系中的sgRNA，作者转向一个全RNA递送平台，联合递送sgRNA和编码Cas9的mRNA。并通过核转染的方式联合或连续递送Cas9和各种靶向IL2RG的合成sgRNA，探索化学修饰是否对sgRNA活性的半衰期有影响。之后，作者比较了未修饰和MS修饰的sgRNA在脱靶位点的活性。研究发现，当化学修饰的sgRNA与Cas9 mRNA共同递送或作为RNP递送时，在人类细胞系中显示出比未修饰的sgRNA更具优势的基因编辑。
图1.CRISPR/Cas系统（图片来源于网络）
02
CRISPR/Cas系统具体是如何来抵御外来病毒入侵的呢？
其过程主要有以下三个阶段：
1、适应阶段：将外来的病毒或噬菌体的DNA片段作为间隔序列（spacer）整合到CRISPR array；
2、表达阶段：CRISPR array被转录为初级转录产物pre-crRNA，pre-crRNA被Cas蛋白加工产生成熟的CRISPR RNA（crRNA）；
3、干扰阶段：成熟的crRNA与Cas蛋白形成核糖核蛋白复合体，crRNA引导Cas蛋白特异性靶向切割入侵者的核酸，达到免疫防御的目的。
1、适应阶段：将外来的病毒或噬菌体的DNA片段作为间隔序列（spacer）整合到CRISPR array；
2、表达阶段：CRISPR array被转录为初级转录产物pre-crRNA，pre-crRNA被Cas蛋白加工产生成熟的CRISPR RNA（crRNA）；
3、干扰阶段：成熟的crRNA与Cas蛋白形成核糖核蛋白复合体，crRNA引导Cas蛋白特异性靶向切割入侵者的核酸，达到免疫防御的目的。
图2.CRISPR-Cas免疫涉及三个不同的机制阶段（图片来源于网络）
知道了CRISPR/Cas的来源及在细菌免疫系统中发挥的作用，人们开始将此免疫系统应用在基因编辑上，那么我们再一起看一下CRISPR/Cas系统是如何应用到CRISPR检测的呢？
03
CRISPR检测原理
CRISPR检测技术所用的Cas蛋白主要有Cas12、Cas13和Cas14，与Cas9不同的是，Cas12、Cas13和Cas14除了具有特异性切割靶序列的功能外，在切割靶标序列之后，还具有非特异性切割其它核酸序列的功能（即Cas蛋白的反式切割活性）。在反式切割激活的状态下，可非特异性切割任意单链，将体系中的荧光标记探针切碎，即可用来检测信号。由此开展各种基因检测技术。
以Cas12a为例：Cas蛋白反式切割活性激活过程
Cas12a处理其自身的crRNA5’端，dsDNA靶标识别始于WED和PI结构域的PAM识别，从而促进dsDNA靶标的展开。
r-环的形成是由TS结合crRNA片段而启动的。过程的crRNA-TS配对，同时TS-NTS展开导致形成完整的r-环。crRNA-TS DNA氢化诱导REC叶的构象变化，导致RuvC结构域的催化位点的变构解封。NTS结合槽引导移位的NTS向RuvC催化位点移动，导致NTS的顺式裂解。
随后，进一步解开pam-远端TS-NTS双链，使TS进入RuvC催化位点，导致TS的顺式裂解。pam-远端dsDNA被释放，而PAM-近端dsDNA仍然与Cas12a-crRNA复合物结合。这使得Cas12a保持在一个催化激活的构象中，这允许非靶标ssDNA的反式裂解。
主要概括为以下四个步骤：
1、Cas12a蛋白的WED和PI结构域识别dsDNA靶标的PAM序列，从而促进dsDNA靶标的展开。
2、crRNA和靶标链互补配对，和非靶标链行成R-loop环。
3、REC远离RuvC，RuvC结构域切割位点暴露，顺式切割非靶标链和靶标链。
4、PAM远端dsDNA被释放，Cas12a-crRNA复合物与近端dsDNA结合，Cas12a反式裂解被激活。
以Cas12a为例：Cas蛋白反式切割活性激活过程
Cas12a处理其自身的crRNA5’端，dsDNA靶标识别始于WED和PI结构域的PAM识别，从而促进dsDNA靶标的展开。
r-环的形成是由TS结合crRNA片段而启动的。过程的crRNA-TS配对，同时TS-NTS展开导致形成完整的r-环。crRNA-TS DNA氢化诱导REC叶的构象变化，导致RuvC结构域的催化位点的变构解封。NTS结合槽引导移位的NTS向RuvC催化位点移动，导致NTS的顺式裂解。
随后，进一步解开pam-远端TS-NTS双链，使TS进入RuvC催化位点，导致TS的顺式裂解。pam-远端dsDNA被释放，而PAM-近端dsDNA仍然与Cas12a-crRNA复合物结合。这使得Cas12a保持在一个催化激活的构象中，这允许非靶标ssDNA的反式裂解。
主要概括为以下四个步骤：
1、Cas12a蛋白的WED和PI结构域识别dsDNA靶标的PAM序列，从而促进dsDNA靶标的展开。
2、crRNA和靶标链互补配对，和非靶标链行成R-loop环。
3、REC远离RuvC，RuvC结构域切割位点暴露，顺式切割非靶标链和靶标链。
4、PAM远端dsDNA被释放，Cas12a-crRNA复合物与近端dsDNA结合，Cas12a反式裂解被激活。
图3 Cas12a介导的DNA顺式和反式裂解模型图（图片来源于网络）
一句话概括来说CRISPR检测就是由靶标核酸激活Cas蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成靶标核酸检测的过程。
（图片来源于网络）
艾迪基因专注于CRISPR技术，提供一系列高质量的基因编辑服务和体外诊断产品：CRISPR文库筛选、细胞基因编辑、单克隆筛选、CRISPR检测。致力于为CRISPR相关、基因功能研究相关、体外诊断以及治疗相关的科学研究提供最高效的技术服务。
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