一窥基因编辑“顶流”的秘密：Cas9蛋白的双叶结构解析

【干货分享】Cas9蛋白的双叶结构与非活性状态（Apo-Cas9）构象

“物质基础决定上层建筑”，在生命体系中同样适用。

蛋白质精细的结构特征赋予蛋白质不同的功能。序列各异的基因编码出纷繁多变的肽链，而肽链经过剪接、修饰、折叠，又形成丰富多彩的蛋白质结构。

甚至同一种蛋白质，在不同的条件下其构象还会发生变化，以适应不同的生命需求。正因如此，解析蛋白质在不同状态下的三维结构，成为理解其功能机制的关键。

近十年来，冷冻电镜技术的快速发展，使科学家得以在接近生理条件的状态下捕捉蛋白质的多种构象，为揭示其动态结构提供了强有力的工具。

Cas蛋白家族作为生物医药领域中的“顶流”，其蛋白结构的秘密自然也是科学家们关注的重点。本文将以时下最热门的Cas9蛋白为例，带领大家一窥其构象的秘密。

Cas9蛋白的双叶结构

Cas9的结构可以分为两大部分，或者称为两个“叶”（Lobe），包括识别（Recognition，REC）叶和核酸酶（Nuclease，NUC）叶。

REC叶由三个α-螺旋识别结构域（REC I，REC II，Rec III）组成，能感知并验证sgRNA或crRNA与靶DNA的配对是否正确。REC叶结构独特，与其他已知蛋白没有相似性或同源性。

NUC叶则包含保守的NHN结构域和被分割为三部分的RuvC-like结构域（RuvC I，RuvC II，RuvC III）。

l 以spCas9一级结构（图A）为例，RuvC I区域位于肽链的N端，并通过一段富含精氨酸的桥螺旋（Bridge Helix，BH）与REC叶连接；

l REC叶的C端紧邻着RuvC II，随后是NHN结构域以及被其隔开的RuvC III；

l 从RuvC III延伸出来的PAM相互作用域（PAM Interacting，PI）则位于整个Cas9蛋白的最C端。

三个RuvC片段能通过肽链的折叠，在三维空间上彼此靠近，拼凑出核酸酶催化核心。被分割的RuvC-like结构域是Cas9蛋白独有的特征——原核生物中经典的RuvC酶通常是一个连续、紧凑的球状结构域；而Cas9蛋白中RuvC区域由于被REC叶和NHN结构域分隔，其活性受到HNH结构域与REC叶的调控，能在非激活构象与激活构象

之间灵活切换，赋予了Cas9精准切割的能力。

Apo-Cas9的构象特征

基因编辑的实现依靠Cas9与sgRNA形成的复合体。

未与sgRNA结合时，Cas9蛋白的DNA切割活性并未激活，这种状态被称为Apo状态。Apo源于希腊语ἀπό，其核心含义是“脱离”。在生物化学与分子生物学领域，Apo状态常用来指代蛋白质“脱离”了发挥功能所必需的配体（如底物、辅因子、辅基）时的构象。

基于冷冻电镜技术的观察结果，在未结合 sgRNA 与靶 DNA 的 Apo 状态下，Cas9的REC叶与NUC叶相对闭合，二者之间容纳核酸的沟槽尚未完全打开。REC叶三个子结构域处于非活性排列，桥螺旋也保持相对平直的构象，二者富含正电荷的表面均未暴露或未成形，无法与带负电荷的DNA互相作用。

RuvC域的三个片段未正确组装，催化核心尚未形成，NHN结构域亦远离切割位置。而PI区域的电子信号模糊弥散，因为PI序列此时没有一个稳定的构像，如同一条柔软的“尾巴”在不停地扭转摆动。以上证据均表明Apo-Cas9并不具备切割活性。

Apo状态下REC叶的调控功能

然而近来的研究表明，Apo-Cas9并非全无功能。

在2025年9月3日，密歇根大学的团队发现脑膜炎奈瑟菌Cas9（NmeCas9）能根据胞内crRNA丰度，调控细菌免疫系统获取病毒特征序列的效率。通过删除NmeCas9中的不同结构域，科学家们进一步确认了NUC叶参与了获取特征序列的过程，而REC叶则介导了crRNA丰度对Apo-Cas9活动的调节。

这也从另一个角度体现了REC叶通过其核酸识别功能参与了Cas9全酶的功能调控。

结语

无论是作为基因编辑工具，抑或是作为细菌免疫系统的研究对象，Cas9蛋白都备受研究人员关注，是生命科学领域里当之无愧的“C位”。

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参考文献

1. Zhou, Xufei et al. “Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition.” Nature vol. 647,8091 (2025): 1054-1062. doi:10.1038/s41586-025-09577-9
2. Babu, Kesavan et al. “Coordinated Actions of Cas9 HNH and RuvC Nuclease Domains Are Regulated by the Bridge Helix and the Target DNA Sequence.” Biochemistry vol. 60,49 (2021): 3783-3800. doi:10.1021/acs.biochem.1c00354