【干货分享】基因敲除常用转染方法及其对比

基因敲除常用转染方法及其对比

基因敲除是指使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程，在生命科学、医学和药物研发等领域都有着广泛的应用前景，如利用基因敲除技术建立疾病模型、进行药物筛选和靶点验证、敲除致病基因实现对疾病的基因治疗等。

转染是将小分子如DNA、RNA或抗体强制引入真核细胞，常用的基因敲除转染方法有慢病毒法、化学法（Lipo）和电转法（RNP），这些方法各有千秋，在实验中往往会有不同的表现和限制。

慢病毒法

慢病毒法是指利用慢病毒作为载体，通过两端长末端重复序列（LTR）让慢病毒的基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点。如果我们人为地把LTR之间的序列替换成我们的目的基因序列，在病毒感染细胞后可随宿主细胞分裂传递给子代细胞，LTRs之间的序列和包括LTRs在内的序列就这样被整合到宿主基因组中，能够稳定地在细胞内表达。

慢病毒法允许将基因敲除体系中的Cas9蛋白单独分离出来先表达，这为余下的gRNA、筛选基因、重组模板等元件的导入方法提供了更多的设计和选择空间，在稳定表达Cas9蛋白的细胞系上进行基因敲除比瞬时转染Cas9进行基因敲除的效率更高。但慢病毒法转染会在敲除靶基因的同时引入新的基因，转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险，且转染周期太长，携带基因长度有限，对实验要求比较高。

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化学法（Lipo）

脂质体介导转染法（Lipofectamine）是一种使用脂质体作为载体，将DNA或RNA等核酸分子包裹到亲水性核心内部，脂质体颗粒所带的正电荷与细胞膜表面的负电荷通过电荷间的相互作用使脂质体与细胞膜融合，通过细胞内吞作用将核酸分子导入细胞内的技术。

脂质体介导的转染技术通常具有较高的转染效率，能够将大量的核酸分子导入细胞，操作相对简便，不需要复杂的设备和技能。但该方法通常具有较大的细胞毒性，对细胞要求比较高，并非所有细胞都能使用该方法进行转染。

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电转法（RNP）

电转法是一种物理转染方式，通过向受体细胞施加短暂的高压脉冲电流，使质膜形成纳米大小微孔，遗传物质、蛋白质或其他分子通过这些微孔进入细胞质中，一旦电脉冲关闭，小孔开始闭合，细胞恢复正常状态，从而达到转染的目的。

电转染可以实现高效的细胞转染，适用于大分子、负电荷或者难以渗透细胞膜的物质，电转染法操作简便快捷，实验结果可重现，并且无载体要求，对细胞类型的依赖性小。

但电转法的高电压脉冲对细胞损伤较大，仅部分细胞膜可以成功修复，容易引起大量细胞死亡，相比化学转染方法，电转染需要使用更多数量的细胞，且参数必须经过仔细优化，包括电压、电阻、电容等，以平衡电转效率和细胞存活率。