Nature重磅：Prime Assembly实现11 kb大片段DNA精准插入
先导编辑（PE）已实现精准的单碱基替换和小片段插入，但大片段DNA的定点整合仍是挑战。
2026年4月29日，Nature在线发表“Prime assembly with linear DNA donors enables large genomic insertions”，报道了Prime Assembly（PA）策略。该方法在PE体系基础上，利用双先导编辑（twinPE）产生的单链flap与线性DNA供体末端互补配对，实现0.1 kb至11 kb片段的精准插入，效率最高达40%。
PA不依赖同源重组或外源整合酶，在非分裂细胞中也有效，为大片段基因治疗提供了更灵活、安全的方案。
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大片段基因组插入的挑战与PE的贡献
先导编辑（Prime Editing）技术已实现了精准的单碱基替换和小片段插入，无需DNA双链断裂，大大提高了编辑安全性。
然而，针对超过数百碱基的大片段DNA（如全长基因cDNA）的定点插入，仍存在效率瓶颈。
传统依赖同源定向修复（HDR）的方法在非分裂细胞中效率低，且易产生p53激活和细胞毒性；而基于整合酶的系统则可能留下连接疤痕，且外源蛋白存在免疫原性和递送难题。因此，在PE基础上开发高效、精准、安全的大片段插入方法，是该领域亟需突破的方向。
02
Prime Assembly（PA）的设计原理：在PE体系上的巧妙升级
研究者提出了一种全新的Prime Assembly（PA）策略。
其核心思路是：利用双先导编辑（twinPE，即使用两个pegRNA）在基因组靶点处产生两个单链flap（约35 nt），这两个flap与线性双链DNA供体的两端序列互补。当共转染PE6c、twinPE的pegRNA以及PCR扩增的线性dsDNA供体后，细胞内的DNA修复机制会促使供体的末端与flap退火并完成连接，从而实现供体DNA的精准插入。
该方法不依赖外源逆转录酶或DNA聚合酶来合成长链DNA，而是直接利用外源DNA供体，绕开了PE合成长片段的瓶颈。同时，PA使用的线性DNA供体可通过PCR轻松制备，避免了质粒的免疫原性问题，保持了PE体系无DSB的优势。
图 1. Prime Assembly技术原理图03
高效精准的大片段插入：从0.8 kb到11 kb
在HEK293T细胞的AAVS1安全港位点，研究者测试了0.8 kb供体的插入。
结果显示，只有同时存在PE6c、两个pegRNA和线性dsDNA供体时，才出现明显的插入条带，而使用环形质粒供体则几乎无插入。Sanger测序证实插入边界精准。与已有的PAINT 3.0和evoCAST技术相比，PA的插入效率显著更高（PA约20% vs PAINT/evoCAST约5%）。
PA不仅适用于0.8 kb，还能高效插入2.2 kb和4 kb的供体。更令人振奋的是，研究者成功将全长11.3 kb的DMD（抗肌萎缩蛋白）cDNA插入到AAVS1位点，ddPCR定量显示插入效率约10%，并通过外侧引物PCR、Southern blot等方法验证了全长插入的准确性。
图 2. Prime Assembly介导11.3 kb全长DMD cDNA精准插入04
高特异性和精准度
为评估PA的全基因组特异性，研究者开发了PA-tag（基于PE-tag/UDiTaS）。
结果显示，PA仅在靶位点检测到显著的插入信号，脱靶极少。对插入边界进行扩增子测序发现，精确连接的比例高达83-88%，考虑到测序误差，实际编辑精度可能接近95%。加入DNA-PK抑制剂AZD-7648后，精确率进一步提升至88-91%，同时插入效率也提高。
05
优化策略：拆分供体组装与应用前景
为克服长片段PCR的合成限制，研究者模仿Gibson组装，将大片段拆分为多个有重叠（30 bp）的小片段供体。
共转染两个重叠的GFP片段（各约430 bp），成功组装并插入0.8 kb的完整GFP序列，效率约30%；甚至三个重叠的AAT基因片段（总长1.9 kb）也能在细胞内正确组装和插入。这一拆分策略为突破长片段DNA合成瓶颈提供了实用方案。
为验证治疗相关应用，研究者将2.4 kb的CD19-CAR基因插入到T细胞受体α恒定区（TRAC）位点，成功实现了CAR基因的定点整合，展示了PA在通用型CAR-T细胞制备中的潜力。
06
PE家族的新成员——PA
Prime Assembly技术是在先导编辑体系上的重要拓展，它利用twinPE产生的flap与线性DNA供体末端互补配对，实现了哺乳动物细胞中高达11 kb的大片段DNA高效、精准、无疤痕插入。
该技术继承了PE无需DNA双链断裂的优点，同时不依赖外源整合酶或质粒，免疫原性低，递送更简单，且兼容分裂和非分裂细胞，为基因治疗（如DMD、血友病等大基因替换）、细胞疗法（CAR-T定点整合）以及复杂基因组工程提供了强大且安全的新工具。
艾迪基因作为先导编辑技术的积极推动者，密切关注PE及其衍生技术（如PA）的前沿进展，致力于为科研用户提供从工具到模型的完整解决方案。
在技术服务层面，我们依托自研的Bingo™7先导编辑平台，可高效完成基因敲入、疾病相关点突变细胞系构建及定制化基因敲除项目；
在现货产品层面，艾迪基因拥有超5000种现货基因编辑细胞株，涵盖免疫、神经、癌症等各研究领域的热门靶点，每株细胞均经Sanger测序、STR鉴定及无菌无支原体检测，确保基因型准确、细胞活力高。
参考文献
Liu, B., et al. (2026). Prime assembly with linear DNA donors enables large genomic insertions. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-026-10460-4
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