没有CRISPR之前，我们怎么编辑基因？

自从20世纪50年代DNA的双螺旋结构被发现以来，人类逐步认识到基因序列的改变会影响细胞功能，并由此开始了对基因编辑的探索。 从广义上来讲，只要对内源基因序列进行人为改动——包括敲除、插入、替换或扰乱调控区域等——都可以被视为基因编辑。

随着对测序技术和分子遗传学的发展，人们愈发明确：许多重要的生物学表型差异乃至疾病都源于基因序列中的微小变化。单碱基替换（基因点突变）是最常见的遗传变异形式之一，即 DNA 中单个碱基或碱基对发生改变。它既可能自发出现，也可能由外界因素诱发，能够改变蛋白质功能或基因表达，产生同义、错义或无义突变等不同后果。

在已鉴定的数万条遗传病相关变异中，单碱基替换占比最高，这推动了更高精度基因编辑工具的研发，使研究人员能够更准确地模拟、纠正或研究这些变异，从而用于基础研究、疾病机制探索及药物靶点验证等方向。

图1. 基因编辑各种方式示意图

早期基因编辑技术经历了从依赖自然机制到人工设计核酸酶的演变。下面，我们重点介绍三种关键技术： 基因打靶、锌指核酸酶（ZFN）和转录激活子样效应子核酸内切酶（TALEN） 。这些技术奠定了现代基因编辑的基础，推动了遗传学、发育生物学和医学研究的进步。

基因打靶：哺乳动物基因编辑的先河

基因打靶（gene targeting） 是早期基因工程中一种定点修改基因组 DNA的方法。通过设计与目标基因相同的 DNA 片段（带有修饰或标记），利用细胞自身的同源重组机制将外源 DNA 整合到特定位置。

▌ 技术原理
基因打靶的核心是同源重组：细胞中存在一种自然的DNA修复机制，能够利用与断裂DNA匹配的DNA模板进行修复。科学家设计“靶向载体（targeting vector）”，其两端包含与目标基因序列相同的“同源臂”，中间插入想要敲入或替换的基因片段（如标记、报告基因等）。

基因打靶的流程大致分为两步：
1. 在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行基因编辑
通过构建基因打靶载体，利用电击穿孔法进行ES细胞转染，实现对ES细胞的基因打靶。

2. 基因修饰小鼠的生成
利用显微注射的方法，将筛选出的携带基因突变的ES细胞注入小鼠的胚泡中。待嵌合体小鼠诞生后，通过回交测试ES细胞是否分化进入了生殖腺，最终完成基因打靶的操作。

基因打靶技术开拓了哺乳动物基因编辑的先河，为即将出现的多种基因编辑技术奠定了坚实的技术和理论基础。从基因打靶而得到发展的多种基础实验技术，包括干细胞分离、培养以及鉴定技术，电击穿孔转染技术以及显微注射技术，到现在仍被广泛应用。 ;

锌指核酸酶技术（ZFN）：第一代人工基因编辑技术

作为第一代人工基因编辑技术， 锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease, ZFN） 于二十世纪九十年代末由Aaron Klug实验室发现并改造。

该技术通过将锌指蛋白的DNA结合结构域与Fok I核酸内切酶的切割结构域融合，创造出了一种人工嵌合核酸内切酶。

ZFN通过在细胞内特异性诱导DNA双链断裂，显著提升了同源重组修复途径的效率，有效克服了传统基因打靶技术效率低下、应用受限的难题。

▌ 技术原理

ZFN的核心原理是“识别与切割”——DNA序列的特异性识别与双链断裂切割。

图2. 锌指结构示意图

1. DNA识别域：锌指蛋白阵列
锌指蛋白是一种常见的转录因子结构域，由一个锌离子和多个氨基酸（如半胱氨酸和组氨酸）配位稳定，形成像“手指”一样的结构。

每个“手指”结构可以特异性地识别三个碱基，通过将3-6个这样的锌指蛋白串联起来，就形成了一个可识别一段9-18个碱基对的锌指蛋白阵列，从而实现对特定基因组位点的精准定位。 .

2. DNA切割域：FokI 核酸内切酶
FokI 是一种来源于海床黄杆菌的限制性内切酶，在 ZFN 中仅保留其切割结构域，没有 DNA 序列识别能力。

3. 二聚化与切割
ZFN的设计和使用必须以一对的形式进行，分别靶向目标DNA序列的上游和下游。当两个ZFN分子结合到目标位点时，两个Fok I切割域会相互靠近，形成二聚体并被激活，在两个结合位点之间的DNA区域（通常相隔5-7个碱基）进行切割，造成DNA双链断裂（DSB）。

随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复断裂，诱发位点特异性重组，实现基因敲除，敲入或修复。

▌ 临床突破
ZFN在临床应用上取得了突破：2017年11月，首个评估基于ZFN的体内基因组编辑治疗的安全性和耐受性的人体临床研究开始，对黏多糖贮积症I（MPS I）、MPS II和血友病B患者进行试验。研究证明ZFN在体内基因组编辑成功，并在某些患者中短暂提升酶活性至正常水平的一半。尽管存在局限性，ZFN也为后续技术的发展指明了方向。

转录激活子样效应子核酸内切酶（TALEN）：第二代模块化基因编辑工具 Tool

TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，转录激活因子样效应子核酸酶） 是继ZFN之后的第二代人工基因编辑技术。其核心原理是将源自植物病原菌黄单胞菌的TALE蛋白（能特异性识别DNA序列）与FokI核酸酶（负责切割DNA）融合，从而在基因组的特定位置实现精准的双链断裂，进而诱导细胞进行基因敲除、敲入或修复。相比ZFN，TALEN在序列设计和靶向特异性上更具优势，更易操作。

图3. TALEN结构示意图

▌ 技术原理

TALEN的核心是TALE蛋白，其由三部分组成：核定位信号、转录激活结构域和DNA识别结构域。DNA识别结构域由多个串联重复单体组成，每个单体识别一个碱基，其中第12位和第13位氨基酸（RVD, repeat variable di-residue）决定识别特异性。

在TALEN中，TALE DNA识别结构域与Fok I核酸酶切割结构域融合，形成人工核酸内切酶。只有当一对TALEN分别结合其相邻靶序列时，Fok I才能通过二聚化被激活并切开DNA，产生双链断裂（DSB）。细胞随后通过NHEJ或HDR修复产生敲除或精确敲入。

三种技术优缺点对比

技术	优点	缺点
基因打靶	精准度高；不依赖特定序列；	效率低；操作周期长；技术要求高；
ZFN	适合敲入较大片段；编辑效率较高；	设计复杂；脱靶/细胞毒性风险；序列限制明显；构建成本高；
TALEN	特异性高，脱靶低；序列设计灵活；可靶向多数基因序列；	蛋白较大，载体传递困难；构建与拼接工作量大；成本和操作门槛仍高；

TALEN技术以其模块化的蛋白质设计，实现了DNA识别与切割功能的革命性解耦，标志着基因编辑工具在特异性、灵活性与安全性上的一次关键性跨越。它有效克服了ZFN技术的诸多局限性，通过可编程的DNA结合域极大地扩展了靶向范围，并显著降低了脱靶效应与细胞毒性，从而将可编辑基因组的范围拓展至近乎任意序列。

TALEN的成功应用不仅验证了高效、精准基因编辑的广泛可行性，其模块化思路也为后续CRISPR等更简洁、更强大的基因编辑工具的研发与优化提供了关键性的设计理念与实践经验。