高效定点整合平台

技术平台介绍

高效定点整合平台(FLASH-KI):精准写入,高效可达

基因敲入(Knock-in, KI)是实现内源基因荧光标记、报告基因插入或点突变修饰的关键技术,广泛应用于蛋白动态示踪、细胞系开发、疾病模型构建及药物筛选等领域。然而,传统KI方法依赖同源定向修复(HDR),在大多数细胞中效率极低、细胞损伤大、筛选周期漫长,成为细胞模型构建的核心瓶颈。
为解决这一痛点,艾迪基因基于FLASH-KI技术平台,整合了高效递送系统与细胞修复通路调控两大核心技术。通过将精准编辑元件与瞬时效率增益方案相结合,实现了在多种难转染细胞(如hESC、iPS)及复杂基因座上的高效、低毒、无需药物筛选的精准敲入。
服务优势

核心技术一:FLASH-KI递送系统

传统敲入策略通常需要分别递送Cas9蛋白、sgRNA与Donor模板,步骤繁琐且效率受限。艾迪基因研发的FLASH-KI递送载体,实现了RNP复合物与Donor DNA的同时递送,大幅简化操作流程,提升协同效率。

技术优势
共递送设计:RNP与Donor同步进入细胞,提高修复模板与编辑位点的时空匹配度
低细胞毒性:蛋白递送方式,避免DNA质粒带来的免疫原性与随机整合风险
广谱适用:已验证覆盖400+细胞系,包括iPSC、hESC、类器官等难转染细胞
无需药物筛选:在多个靶点实现无需富集即可获得高纯度细胞池

核心技术二:NHEJ抑制剂——KI enhancer drug

在CRISPR介导的DNA双链断裂修复中,NHEJ(非同源末端连接)是主要修复途径,而HDR(同源定向修复)效率通常不足10%。艾迪基因自主研发了NHEJ抑制药物,在编辑过程中短暂、可逆地抑制NHEJ关键蛋白,迫使细胞优先选择HDR途径进行修复。

技术优势
显著提升敲入效率:在多种细胞系中验证,敲入效率提升5-7倍
可逆抑制:药物作用时间可控,不影响细胞长期活力与功能
无需基因改造:不依赖细胞系修饰,适用于任何细胞类型
兼容多种递送方式:可与FLASH-KI、电转、脂质体等方式配合使用

服务优势:

FLASH-KI vs. 传统方法

技术指标 传统HDR(质粒/电转) 传统电转(仅Donor) FLASH-KI(+NHEJ抑制) 提升数倍
293T GAPDH敲入效率 约10-15% 68% 88%

1.3倍(vs电转)
5-8倍(vs传统HDR)

A9 T1R1敲入效率 <5% 约10-15% 46% 3-9倍
hESC TH敲入效率 <3% 约5% 20% 4-6倍
无需药物筛选即可获得高纯度池 是(多个靶点已验证) /
细胞活力 60-70% 50-60% >90% 显著提升
注:传统HDR效率数据基于行业文献及内部验证;电转数据为部分细胞系实测;FLASH-KI数据为公司内部测试结果。

不同细胞类型/难度级别下的预期表现(FLASH-KI平台)

细胞难度级别 代表细胞系 预期敲入效率范围 项目成功率(获得纯合单克隆) 交付周期(从启动到交付) 关键影响因素
低难度(常规永生化细胞系)
HEK293、HeLa、CHO、HCT-116 60-90% >90% 8-10 周 靶点位点、Donor设计质量
⭐⭐中难度(难转染细胞系、部分悬浮细胞)
A9、THP-1、K562、urkat 30-60% 70-80% 10-12 周 细胞状态、转染参数、NHEJ抑制药物浓度
⭐⭐⭐高难度(干细胞、原代细胞、类器官)
iPSC、hESC、原代T细胞、类器官 15-30% 60-70% 12-14 周 细胞健康度、单克隆形成效率
说明:
 Pool效率:指转染后未进行单克隆筛选的细胞群体中,正确敲入细胞的比例(通过流式或测序检测)。
项目成功率:指最终能够交付至少1株纯合单克隆细胞系的项目比例。
以上数据基于公司内部已完成的100+敲入项目统计。
服务类型

标准型KI:单克隆细胞系 + 测序验证。

高纯度细胞池(pool):对于易转染细胞、GAPDH、ACTB等看家基因,直接交付80%以上阳性率的细胞池,省去单克隆筛选时间。

难转染细胞定制:针对hESC、iPSC、原代细胞专属优化方案,确保获得背景单一阳性单克隆细胞。

技术流程

技术应用案例
  1. 截至2026年第一季度,FLASH-KI技术平台已完成20+个商业项目交付,覆盖永生化细胞、肿瘤细胞、干细胞等多种类细胞系,实现插入片段长度0.5-5.5kb的精准整合,整体项目成功率98.6%,其中5500bp以下片段敲入成功率达100%。

案例一:高丰度表达基因精准敲入(HEK293T-GAPDH-EGFP)

客户需求:在HEK293T细胞系GAPDH基因C端插入EGFP荧光标签(841 bp),用于活细胞动态示踪研究,要求无药物筛选压力下获得高纯度阳性细胞群。

技术对比:传统电转法阳性率仅68%且伴随30%细胞死亡;采用FLASH-KI递送系统实现:①无需抗生素筛选,阳性率提升至88%;②活细胞率保持95%以上;③荧光信号强度均一性提高40%。

项目周期:4周交付88%阳性率的多克隆细胞池;8周获得纯合敲入单克隆细胞系,较行业平均周期缩短30%。


案例二:随机靶点基因完整敲入(A-9-T1R1-CoGFP-Puro)

客户需求:在A-9细胞系T1R1基因位点插入EF1a-CoGFP-T2A-Puro表达框(2115 bp),要求保持受体蛋白天然构象与信号通路完整性。

技术突破:采用FLASH-KI递送系统实现:①无筛选标记情况下阳性率达46%;②活细胞率保持95%以上;③单克隆细胞系稳定性超过15代。

项目周期:5周获得功能性多克隆细胞系;9周完成单克隆筛选与验证。

案例三:人胚胎干细胞基因编辑(hESC-H9-TH-P2A-EGFP)

客户需求:在hESC-H9细胞系TH基因C端插入P2A-NeoR-EF1a-EGFP表达框(2283 bp),要求维持干细胞多能性与分化潜能。

技术优势:针对难转染干细胞的技术突破:①无药物筛选阳性率达20%(行业平均<5%);②细胞活率保持90%以上;③Oct4/Sox2多能性标志物表达正常。

项目周期:5周获得20%阳性率多克隆细胞;11周完成单克隆鉴定。

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