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FAQ
艾迪基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
艾迪基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
什么是慢病毒包装？
慢病毒是一种将外源基因导入细胞的基因递送工具。通过如293T等工具细胞，将带有目标DNA片段的慢病毒载体包装成具有细胞感染活性的慢病毒颗粒。这个包装过程包括：构建慢病毒载体、准备包装质粒、工具细胞培养、质粒转染、收集病毒颗粒、病毒颗粒纯化和浓缩和滴度测定等过程。
慢病毒转导后，细胞状态很差甚至出现大量死亡，如何解决？
细胞被慢病毒感染后，细胞状态不佳，这种情况有较多可能的因素导致的，以下是一些可能的原因和相应的解决方案：
1.病毒滴度过高：高滴度的慢病毒可能导致细胞毒性，使细胞无法正常生长。解决方案是降低病毒的滴度，进行一系列稀释实验，找到一个既能有效转染又不影响细胞生长的滴度
2.细胞状态不佳：感染前细胞的健康状态可能影响感染后的生长。解决方案是确保细胞在最佳状态下进行感染，例如在感染前24小时换新鲜培养基，并确保细胞密度适中
1.病毒滴度过高：高滴度的慢病毒可能导致细胞毒性，使细胞无法正常生长。解决方案是降低病毒的滴度，进行一系列稀释实验，找到一个既能有效转染又不影响细胞生长的滴度
2.细胞状态不佳：感染前细胞的健康状态可能影响感染后的生长。解决方案是确保细胞在最佳状态下进行感染，例如在感染前24小时换新鲜培养基，并确保细胞密度适中
什么是单克隆筛选，为什么它在基因编辑研究中如此重要？
单克隆筛选是从混合细胞池中分选出单个克隆，并由该克隆培养扩增成细胞系。单克隆筛选保证了使用的细胞系是来源于同一个细胞，并且确保了遗传背景的高度一致。在细胞被基因编辑或基因修饰后，初始细胞池的每个细胞的遗传背景的差异是巨大的，这样的细胞池用于后续的实验，实验结果无疑是不准确的。通过单克隆筛选，可以获得遗传背景一致、具有稳定基因编辑的细胞群体，监测到的表型变化才是稳定准确的。
艾迪基因在单克隆筛选过程中如何确保细胞的纯度和稳定性？
艾迪基因采用的3D单细胞打印技术采用非接触性操作，避免了机械损伤和背景污染的问题，有助于维持细胞的完整性和生物活性。3D单细胞打印技术可以避免传统的有限稀释法分单克隆时的人为误差，保证筛选结果的可靠性。
如何选择合适的细胞进行文库筛选？
细胞选择可以遵循以下原则：
1）与研究目的相符
2）sgRNA文库靶向的基因要与细胞的属源相符
3）细胞可以稳定传代
4）转染效率高
尽量不选用原代细胞。由于原代细胞无法稳定传代，可能在文库筛选实验的过程中，原代细胞已经出现大量死亡，无法完成实验。如果选用原代细胞进行文库筛选，为了解决上述的风险，可以通过降低细胞覆盖度和选择gRNA数较小的文库进行筛选，尽可能降低文库细胞池的数量和缩短实验周期。
1）与研究目的相符
2）sgRNA文库靶向的基因要与细胞的属源相符
3）细胞可以稳定传代
4）转染效率高
尽量不选用原代细胞。由于原代细胞无法稳定传代，可能在文库筛选实验的过程中，原代细胞已经出现大量死亡，无法完成实验。如果选用原代细胞进行文库筛选，为了解决上述的风险，可以通过降低细胞覆盖度和选择gRNA数较小的文库进行筛选，尽可能降低文库细胞池的数量和缩短实验周期。
如何选择合适的基因递送方式？
选择适合的基因传递系统需要根据具体实验条件、研究目的以及细胞类型等因素综合评估。定量比较各种系统的传递效率、细胞毒性和稳定性等是进一步明确选择的重要步骤。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
在进行基因递送时，培养细胞需要注意哪些问题？
保持细胞培养物的活性，不要让细胞保持汇合超过24小时。解冻新细胞可以恢复转染活性。最佳的细胞铺板密度对于不同的细胞类型或应用而言是不同的，但对于贴壁细胞，转染时汇合度在70%至90%或细胞密度为5×10^5至2×10^6个悬浮细胞/ml通常会产生良好的转染结果。确保细胞在转染时未完全汇合或处于固定相。
一般CRISPR相关试剂以及Cas蛋白可以存放多久？
CRISPR检测相关试剂：
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
Cas9、Cas12和Cas13三者之间有什么区别？
Cas9、Cas12和Cas13三者的主要区别在于作用过程有差异：
Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。
Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。
dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性吗？哪种效率更高？
双链DNA靶标和单链DNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性(trans-cleavage，又名collateral cleavage)，这点与Cas12b相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。
如何提高Cas酶的检测灵敏度？
1）设计高效的crRNA序列。通过合理的设计以及在线网站结构预测，选择合适的crRNA,以获得良好的Cas酶反式切割活性。
2）选择合适的信号报告底物。有关研究指出，使用15 nt的单链DNA（ssDNA）作为报告底物时，Cas12a的切割反应速率达到最大值，相较于常用的5-nt ssDNA，反应速率显著提升。
3）优化反应条件和缓冲液。通过优化CRISPR反应的条件如Cas酶与crRNA比例、Cas酶使用浓度、反应温度等可以在一定程度上提高检测效果。
2）选择合适的信号报告底物。有关研究指出，使用15 nt的单链DNA（ssDNA）作为报告底物时，Cas12a的切割反应速率达到最大值，相较于常用的5-nt ssDNA，反应速率显著提升。
3）优化反应条件和缓冲液。通过优化CRISPR反应的条件如Cas酶与crRNA比例、Cas酶使用浓度、反应温度等可以在一定程度上提高检测效果。
如何设计crRNA？
可根据以下步骤进行设计
1）明确目的基因序列。
2）明确使用的Cas蛋白。不同的Cas蛋白，需要识别相应的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，例如Cas12a需要依靠“TTTV”PAM序列进行靶标识别。
3）选择crRNA靶向区域。在目标基因上选择一个20nt核苷酸序列，该序列紧邻PAM位点，且与crRNA的互补链配对。
4）选定的20nt靶向区域作为 target sequence（可变部分）加上scaffold sequence （固定部分）以设计crRNA序列。
5）使用在线工具如CRISPR design tool（例如CRISPOR、 Benchling等）来帮助设计crRNA。这些工具可以预测sgRNA的效率和特异性，避免可能的脱靶效应。
6）设计完成后，可以通过合成生物学公司订购合成的crRNA序列。
1）明确目的基因序列。
2）明确使用的Cas蛋白。不同的Cas蛋白，需要识别相应的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，例如Cas12a需要依靠“TTTV”PAM序列进行靶标识别。
3）选择crRNA靶向区域。在目标基因上选择一个20nt核苷酸序列，该序列紧邻PAM位点，且与crRNA的互补链配对。
4）选定的20nt靶向区域作为 target sequence（可变部分）加上scaffold sequence （固定部分）以设计crRNA序列。
5）使用在线工具如CRISPR design tool（例如CRISPOR、 Benchling等）来帮助设计crRNA。这些工具可以预测sgRNA的效率和特异性，避免可能的脱靶效应。
6）设计完成后，可以通过合成生物学公司订购合成的crRNA序列。
为什么选择艾迪基因构建过表达稳转细胞系？
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