在功能基因组学、疾病机制研究和细胞治疗开发中，稳定表达细胞模型是支撑长期实验的基础设施。无论是比较同一基因的不同突变体，还是在同一遗传背景下平行测试多个候选基因，研究者真正需要的往往不是“某一个克隆”，而是一套遗传背景一致、表达水平可比、且能够不断扩充的模型体系。

然而，传统基因整合路线长期受制于几个瓶颈：

随机整合的位置效应：外源基因随机插入基因组，不同克隆间的表达水平可相差数倍，且随传代发生沉默漂移，导致数据难以重复。

HDR 介导的定点敲入效率通常会随载荷增大而下降：当片段达到数 kb 或更大时，效率会明显受细胞类型、基因座、供体形式与递送方式影响；DMD、ATM 等大型基因的完整编码序列因此更难直接通过常规 HDR 完成整合。

病毒载体存在容量与制备限制：AAV 的有效包装容量较小，慢病毒虽可承载更大片段，但对超大载荷、多基因线路及拷贝数精确控制仍有局限。

每增加一个基因就要重做一轮 sgRNA 设计与单克隆筛选：周期以月计，多基因通路共表达时剂量比例难以控制。

LandingPad™ 基因整合平台采用“先建平台，后装内容”的两步策略，以 Bxb1 重组酶与 attP/attB 位点为核心，在预先构建的着陆细胞中实现大片段 DNA 的定点整合。需要注意的是，单个 attP 位点完成整合后会转化为 attL/attR；平台的“可复用”主要指保存同一母本着陆细胞库，并由此平行构建携带不同载荷的衍生细胞模型。

LandingPad™ 的技术基础是 Bxb1 大丝氨酸重组酶。Bxb1 来源于噬菌体，能够特异性识别两个短序列——attP（噬菌体附着位点）和 attB（细菌附着位点），并催化两者之间的定向重组。

整个工作流程分为两步：

第一步：构建 attP 着陆细胞（一次性）

利用 CRISPR 定点敲入技术，将 attP 序列精准安装到基因组的常用安全港位点（如 AAVS1）或指定治疗相关位点（如 TRAC）。根据位点、细胞类型和供体设计，可采用 Flash-KI™ 或辅助安装着陆位点的精准编辑策略。经单克隆筛选、接头 PCR 与测序验证后，可获得能够冻存、复苏并作为母本细胞库使用的 attP 着陆细胞系。了解Flash-KI™ 平台。

第二步：目标基因整合（可反复进行）

将携带 attB 序列的供体 DNA 与 Bxb1 重组酶共同导入 attP 着陆细胞。Bxb1 催化 attP 与 attB 之间的重组，将目标载荷定点整合到基因组中。重组后形成的 attL 和 attR 通常不再被 Bxb1 单独识别；在不提供重组方向性因子（RDF）的情况下，反向切除不易发生，因而有利于稳定维持已整合载荷。

关键设计规则：基因组安装 attP，供体携带 attB

这是 LandingPad™ 的重要设计原则。已发表研究显示，当在基因组中安装 attB 时，Bxb1 及其部分进化或工程化变体可在与 attB 高度同源的基因组位点发生非预期整合；而在基因组中安装 attP 时，相同研究中检测到的脱靶整合水平较低。

推荐的标准配置为「基因组 attP + 供体 attB + Bxb1 催化」，兼顾效率与特异性。

在实际使用 LandingPad™ 时，以下几个因素直接影响整合效率和细胞株质量。

1. 着陆位点选择

AAVS1 等常用安全港位点具有较多工程化应用经验，但仍需根据细胞背景、插入方向、表达元件及邻近基因转录情况进行验证。若用于细胞治疗研究，TRAC 等治疗相关位点可用于将载荷置于特定的内源调控环境中，但具体表达模式取决于整合盒和位点设计。

2. 供体设计

attB 供体可包含目标载荷、启动子、筛选标记等元件。启动子强度应根据实验需求选择，以减少超生理表达。对于多基因线路，可将多个转录单元组装在同一供体中，或预先构建多位点、正交重组系统。单个 attP 位点完成整合后不能直接继续装入下一个载荷，因此应在立项阶段明确载荷组合方式与所需着陆位点数量。供体中还可评估加入绝缘子或抗沉默元件。

3. 递送方式

递送策略需根据细胞类型、供体尺寸和 Bxb1 形式选择，可包括质粒、mRNA、蛋白或特定病毒载体。对难转染细胞、原代细胞或 iPSC，应通过预实验在进入效率、短期表达、细胞活率和供体完整性之间取得平衡；在适用条件下，艾迪基因 可评估 FLASH 递送系统对 CRISPR 组件与供体共递送的适配性。

4. 与 Flp-In、Cre-loxP 系统的比较

表 1　三种定点整合系统的关键维度对比

1. 同基因背景稳转与过表达模型

将所有载荷整合到同一预验证位点，从源头消除位置效应和克隆异质性。适用于等基因突变体面板（野生型与系列突变体）、旁系同源基因平行表达株，以及报告基因与诱导型表达细胞株的构建。

2. 大基因与大片段疾病模型

Bxb1 系统已在多项研究中实现超过 10 kb 载荷的定点整合。对于 DMD（编码序列约 11 kb）、BRCA2（约 10 kb）、ATM（约 9 kb）等完整编码序列较大的基因，LandingPad™ 提供了值得评估的建模路径，但项目可行性仍取决于供体制备、递送、位点和细胞耐受性。多组分递进构建需预先设计多个或正交着陆位点。

3. 报告系统、基因线路与合成生物学

合成生物学常需要按确定拷贝数和组合方式表达多个转录单元。LandingPad™ 可将不同版本载荷整合到同一预验证位点，或通过多着陆位点设计进行组合，从而降低宿主背景差异对线路比较的干扰。版本迭代时，可从母本着陆细胞库出发更换 attB 供体，而无需重新选择基因组位点。

已发表的多着陆位点 CHO 系统曾实现约 100 kb 异源 DNA、21 个转录单元的可控整合，并在数周内维持表达。该结果来自多着陆位点和特定 CHO 工程化体系，不应直接解读为单个 attP 位点或任意细胞类型均可达到的通用上限。

4. 细胞治疗工程化细胞模型

在 TRAC 等位点定点安装经合理设计的 CAR 盒，有望改善表达一致性并将表达模式置于特定的内源调控环境中。CAR、细胞因子装甲和安全开关等多载荷组合，可通过多转录单元供体或多着陆位点策略迭代。原代 T 细胞与 iPSC 项目还需同步评估细胞活率、表型、拷贝数和功能安全性。

1. attP 着陆细胞构建失败

在部分细胞系中，attP 着陆位点的初次安装效率较低。可优化 sgRNA/编辑位点、供体形式与同源臂、递送参数和富集策略，并根据细胞状态评估 HDR 调控或精确编辑辅助安装方案。高保真 Cas9 的主要价值在于降低非预期切割，而不是直接提高 HDR 效率。

2. 整合效率低或脱靶整合

整合效率会受着陆位点、细胞类型、递送方式、供体尺寸和重组酶版本影响。已发表的 PASSIGE 研究中，进化或工程化 Bxb1 变体在预装着陆位点的人细胞系中对特定供体实现了最高约 60% 的整合；在单次转染、多位点评估中，eeBxb1 的平均定点整合效率约为 23%。这些数据不代表任意细胞或项目的保证值，实际效率应通过预实验确认。遵循“基因组 attP + 供体 attB”配置可降低已知 attB 同源位点相关的脱靶风险，但仍应根据项目要求设置接头验证、拷贝数和非预期整合检测。

3. 阳性克隆表达沉默

部分克隆在长期传代后可能出现表达下降。选择安全港位点、在供体中嵌入抗沉默元件、并通过连续传代验证表达稳定性，是降低该风险的有效手段。

4. 无法反复整合或载荷被切除

首先需明确 Bxb1 的反应方向性：attP 与 attB 重组后形成 attL/attR，在缺少 RDF 时通常不会由 Bxb1 单独高效逆转。这有利于载荷稳定性，但不等于构建过程一定无需药物筛选；是否筛选取决于初始整合效率、供体设计与交付类型。若希望在同一细胞中继续装入新载荷，需要预留额外或正交着陆位点。

如果实验仅需短期过表达一个基因，随机整合或 HDR 敲入可能已足够。但如果研究涉及以下需求，LandingPad™ 更具优势：

需要在同一遗传背景下比较多个突变体或旁系同源基因；
目标基因片段较大（>5 kb），常规 HDR 效率低下；
需要构建多基因线路或报告系统，且对拷贝数和比例有控制要求；
希望建立可反复使用的细胞底盘，后续整合新基因时无需重新设计 sgRNA 和筛选单克隆；
细胞治疗研发中需要在治疗相关位点定点装载多载荷并进行快速迭代。

LandingPad™ 的价值不仅来自 Bxb1 重组酶本身，更来自将着陆位点安装、供体工程、递送与克隆筛选整合为一条可控流程的工程能力。

艾迪基因 可将 Flash-KI™ 定点敲入、精确编辑、FLASH 递送与单克隆筛选能力组合用于 LandingPad™ 项目，但具体路线仍需根据着陆位点、载荷尺寸、细胞类型和交付目标评估。可提供的项目模块包括：

阶段一：attP 着陆细胞系构建（一次性）

在 AAVS1 等常用安全港位点或 TRAC 等指定内源位点评估并安装 attP，经接头 PCR、测序和必要的拷贝数检测确认后，交付可冻存并作为后续项目母本的 attP 着陆细胞株与验证报告。参考周期通常为 8–12 周，具体取决于细胞生长、安装效率和验证要求。

阶段二：目标基因整合（可反复进行）

完成 attB 供体设计与构建，并根据细胞与载荷选择 Bxb1 质粒、mRNA 或蛋白形式。递送后可通过流式、PCR、ddPCR 或测序等方法评估池细胞整合率和接头正确性。池细胞层面的初步检测可在递送后约 1–2 周进行；如需交付单克隆细胞株，还需加上单细胞筛选、扩增与基因型验证周期。是否可获得纯合整合株取决于着陆位点拷贝数和项目设计，不应作为统一交付承诺。

交付内容

attP 着陆细胞株、attB 供体载体或长片段供体、适配的 Bxb1 组件、整合效率与接头验证报告，以及单克隆测序、拷贝数或功能验证报告（按项目需求选择）。具体物料与检测项目应在立项时确认。

对于已有明确靶点、希望建立可扩展着陆细胞库或大片段定点整合模型的研究团队，艾迪基因 可提供从位点与载荷可行性评估、供体设计，到池细胞检测、单克隆筛选和功能验证的项目支持。了解基因敲入细胞系构建服务。