X射线晶体衍射服务｜蛋白质结构解析与共晶结构测定
X 射线晶体衍射（X-ray Crystallography）至今仍是解析蛋白质高分辨率三维结构的主力方法。该方法广泛用于药物靶点结构解析、共晶结构测定与酶分子改造。
艾迪基因提供的不是单次收数据服务，而是一条从基因到结构的完整链路：您只需提供基因序列或蛋白样品，剩下的由我们完成——密码子优化与基因合成、载体构建、表达系统筛选、多步纯化、结晶条件筛选与优化、晶体冷冻与衍射数据收集、相位解析、模型搭建与精修、结构验证与解读，最终交付坐标文件与全套分析资料。
中段切入同样支持：对于已经拥有纯化蛋白的客户，我们也接受从结晶筛选或数据收集环节单独启动，按阶段计费。
技术原理
一、为什么晶体能"看见"原子
蛋白质分子在晶体中按三维点阵规则排列，相当于把数以亿计的分子"对齐"在一起。当一束 X 射线穿过晶体，会被分子中的电子散射，并在特定方向发生相长干涉，形成离散的衍射点。
这一过程遵循布拉格定律：
2d sin θ = nλ
其中 d 为晶面间距，θ 为入射角，λ 为 X 射线波长。通过测量每个衍射点的位置可以确定晶胞参数与空间群，通过测量每个衍射点的强度可以反推电子密度分布，进而在电子密度图中搭建原子模型。
二、为什么必须使用高强度 X 射线源
单个蛋白晶体的衍射信号极弱，实验室微焦斑光源适用于常规晶体；对于衍射微弱、晶体细小或需要异常散射实验（如硒代甲硫氨酸 SAD）的项目，需要使用同步辐射光源——其亮度比常规实验室光源高出数个数量级，可在晶体发生辐射损伤前取得完整数据。艾迪基因与国内同步辐射线站保持稳定合作，按项目需求申请机时。
三、相位问题的三种解法
衍射实验只能测得强度，丢失了相位信息，这是晶体学的核心难题。常用策略如下。
| 方法 | 适用情形 | 说明 |
|---|---|---|
| 分子置换（MR） | 有同源结构（序列一致性通常 > 30%） | 以同源结构为搜索模型，最快、成本最低 |
| 单/多波长反常散射（SAD/MAD） | 无同源结构 | 通过硒代甲硫氨酸衍生或重原子 soaking 引入反常散射信号 |
| 重原子同晶置换（MIR/MIRAS） | 特殊项目 | 制备重原子衍生物，比较同晶对衍射差异 |
标准服务流程
序列评估与设计
基因合成与构建
表达与纯化
结晶筛选与优化
冷冻与衍射
数据处理与解析
建模精修与验证
Step 01: 序列评估与方案设计
分析目标蛋白的分子量、等电点、跨膜区、无序区与翻译后修饰，判断可结晶性风险，确定表达系统与截短、构建边界策略。输出《项目可行性评估与实验方案》。
Step 02: 基因合成与载体构建
密码子优化、基因合成、构建至适配表达载体，可引入亲和标签及蛋白酶切位点。艾迪基因自产基因，周期与质量可控。
Step 03: 蛋白表达与纯化
大肠杆菌、酵母、昆虫细胞与哺乳动物细胞多系统并行试表达；经亲和层析、离子交换与分子筛多步纯化，确保样品单分散性与纯度达标。
Step 04: 结晶筛选与优化
采用坐滴、悬滴气相扩散法，使用商品化筛选试剂盒开展初筛（数百至上千条件），对微晶与成核条件进行梯度优化，包括 pH、沉淀剂、盐浓度、添加剂、蛋白浓度与温度的多轮迭代，必要时引入晶体 seeding 技术提升晶体尺寸与衍射质量。
Step 05: 晶体冷冻与衍射数据收集
挑选合格晶体，使用含低温保护剂的溶液处理后于液氮中速冻至 100 K，降低辐射损伤。经预筛确认衍射能力后，上同步辐射线站采集完整数据集；对硒代衍生样品在吸收边波长处采集反常散射数据。
Step 06: 数据处理与结构解析
衍射图像经索引、积分与缩放处理，评估分辨率、完整度、信噪比与各向异性；通过分子置换或 SAD/MAD 求解相位，计算初始电子密度图。
Step 07: 模型搭建、精修与验证
自动建模结合手动修正完成主链与侧链搭建，加入配体、金属离子与水分子，经多轮实空间与倒空间精修，输出最终模型；使用几何与立体化学指标完成质量验证，并生成结构解读报告。
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技术参数与质控标准
注：以下为行业常见参考区间，实际指标取决于蛋白性质与晶体质量；具体项目在合同中约定验收口径。
| 项目 | 参考值 |
|---|---|
| 样品纯度要求 | ≥ 95%（SDS-PAGE 考染单一条带） |
| 建议样品浓度 | ≥ 5 mg/mL，推荐 10 mg/mL 以上 |
| 结晶筛选条件数 | 初筛 288–1536 条件 |
| 结晶方法 | 坐滴气相扩散、悬滴气相扩散、微量批量法 |
| 结晶温度 | 4 ℃ 与 20 ℃ 双温度并行 |
| 单项目结晶用量 | 通常 0.5–2 mg（视筛选轮次） |
| 项目 | 参考值 |
|---|---|
| 数据收集温度 | 100 K（液氮冷冻） |
| 常用波长 | 常规 0.97–1.00 Å；Se-SAD 约 0.979 Å（吸收边） |
| 光源 | 实验室微焦斑光源 / 同步辐射线站 |
| 数据完整度 | 高分辨率壳层通常要求 ≥ 90% |
| 分辨率判定 | 综合 I/σI、CC1/2 与 R_merge、R_meas 判定有效分辨率 |
以约 2.0 Å 的可溶蛋白为例，各项指标的典型范围如下。
| 指标 | 典型范围 |
|---|---|
| 分辨率 | 1.5–2.5 Å（优质晶体可优于 1.2 Å） |
| R-work / R-free | 约 0.16–0.22 / 0.18–0.25，两者差值通常 < 5% |
| Ramachandran favored | 一般 ≥ 98% |
| Rotamer outliers | < 1% |
| Clashscore | 处于同分辨率结构的合理分位 |
| 键长 / 键角 RMSD | 接近标准几何约束值 |
交付物清单
| 交付项 | 格式 | 说明 |
|---|---|---|
| 原子坐标文件 | PDB / mmCIF | 精修完成的最终模型 |
| 结构因子文件 | MTZ / CIF | 供第三方复算与投稿 |
| 电子密度图 | CCP4 / MTZ | 2Fo−Fc 与 Fo−Fc 图，便于检查关键区域 |
| 衍射原始图像 | 压缩包 | 按项目约定保留与归档 |
| 数据收集与处理报告 | 晶胞参数、空间群、分辨率、完整度、统计表 | |
| 精修与验证报告 | Ramachandran、Clashscore、R-free 等 | |
| 结构图与 PyMOL 源文件 | PNG / PSE | 整体折叠、活性中心、配体口袋高清图 |
| 结果解读报告 | 配体结合模式、关键残基、突变位点结构影响分析 | |
| PDB 提交协助 | — | 协助完成数据库提交并获取 PDB ID |
核心优势
1. 基因到结构的一条链路
自有基因合成与蛋白表达平台，序列确定后即可启动，避免多家供应商交接造成的样品损耗与周期拖延。
2. 结晶环节的高通量与经验库
数百至数千条件的初筛通量，配合沉淀剂、pH、添加剂与 seeding 的多轮优化策略，对难结晶蛋白提供更充分的尝试空间。
3. 同步辐射机时保障
稳定的线站机时资源与成熟的委托收数流程，弱衍射、小晶体与反常散射实验同样有推进路径。
4. 数据可投稿、可复算
交付坐标、结构因子与原始衍射图像，附完整统计与验证报告，能够直面审稿人质疑，也便于课题结题与专利申请。
5. 结构结果与科研目标对齐
不止于给出坐标，还会交付配体结合模式、突变位点影响与活性中心分析，让结构真正进入研究论证链条。
应用场景
| 场景 | 结构能回答的问题 |
|---|---|
| 创新药物发现 | 靶点蛋白的活性口袋形状、关键残基与氢键网络，支撑虚拟筛选与先导物优化 |
| 药物—靶点共晶 | 化合物与靶点的结合模式与构象变化，指导构效关系（SAR）分析 |
| 酶工程与定向进化 | 催化三联体与底物通道的空间排布，定位影响活性与稳定性的突变位点 |
| 抗体与抗原表位 | 抗原—抗体复合物界面的接触残基，解释亲和力与交叉反应来源 |
| 分子机制研究 | 构象变化、别构调控与复合物装配方式的结构证据 |
| 计算与 AI 结构互补 | 为 AlphaFold 等预测模型提供实验验证与修正基准 |
注：对难以结晶的膜蛋白、超大复合物或构象高度动态的样品，可与冷冻电镜（Cryo-EM）方案组合评估，我们会在项目评估阶段给出方法学建议。
送样要求与项目周期
| 送样类型 | 要求 | 备注 |
|---|---|---|
| 基因序列 / 质粒 | 提供 FASTA 序列或重组质粒 | 从基因合成环节启动 |
| 纯化蛋白（湿样） | 纯度 ≥ 95%，浓度 ≥ 5 mg/mL，缓冲液明确 | 4 ℃ 冷链运输，附缓冲液配方 |
| 冻干蛋白 | 注明复溶条件 | 需提前评估复溶后活性与聚集情况 |
| 已有晶体 | 说明结晶条件 | 直接进入衍射与解析阶段 |
送样前请确认：样品不含高浓度甘油、去垢剂或螯合剂干扰；如含还原剂请注明种类与浓度；附 SDS-PAGE 与质谱或分子量鉴定结果。
| 阶段 | 参考周期 |
|---|---|
| 序列评估与方案设计 | 1–2 周 |
| 基因合成与载体构建 | 1–2 周 |
| 表达条件筛选与纯化 | 3–6 周 |
| 结晶筛选与优化 | 4–8 周（波动最大） |
| 数据收集与结构解析 | 1–3 周 |
| 精修、验证与报告 | 1–2 周 |
| 合计（从基因开始） | 约 10–22 周 |
| 合计（已提供合格蛋白） | 约 5–12 周 |
说明：结晶环节是周期波动的主要来源，取决于蛋白本身的结晶性质。项目启动后每阶段出具进度报告，阶段风险提前沟通。
Advantage and Characteristic
Optimazied Strategy
We have create a unique sgRNA Design Logic
Optimazied Strategy
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FAQ
蛋白一定能长出晶体吗？
并非所有蛋白都能获得可供衍射的晶体。我们在启动阶段做可结晶性评估，通过截短构建、同源物种替换、表面熵降低突变、共纯化稳定伴侣等策略提高成功率，并在阶段性节点与客户共同决定是否继续投入。
没有同源结构，还能解结构吗？
可以走实验相位路线：通过硒代甲硫氨酸衍生（Se-Met SAD）或重原子 soaking 引入反常散射信号，代价是需要额外的衍生制备与吸收边数据收集。
我有蛋白样品，只做结晶和数据收集可以吗？
可以。支持从流程中任意环节切入，按阶段报价。
结构与 AlphaFold 预测结果不一致怎么办？
这正是实验结构的价值所在。我们会标注差异区域，并结合电子密度质量说明可信度，帮助判断是预测偏差还是晶体环境导致的构象差异。
数据归属与保密如何保障？
项目数据与结构信息归客户所有，可签署保密协议。未经书面授权，不用于任何对外展示或二次使用。
可以做配体共晶或 soaking 吗？
可以。请提供化合物的溶解度、溶剂耐受性与安全信息，我们评估共结晶与浸泡两条路径的可行性。
结构达不到预期分辨率怎么办？
会先分析限制因素（晶体质量、各向异性、辐射损伤、构象柔性），再给出优化方案或替代方法学建议，并对已交付数据据实说明。
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